将菌株Y16C接种到草甘膦污染的土壤中可以增加具有草甘膦降解能力的微生物丰富度，从而促进草甘膦从环境中的去除。
2022年3月12日，华南农业大学陈少华教授团队等人在Journal of Hazardous Materials发表题为《Characterization of a Novel Glyphosate-degrading Bacterial Species, Chryseobacterium sp. Y16C, and Evaluation of its Effects on Microbial Communities in Glyphosate-contaminated Soil》的文章。除草剂草甘膦在农业生产中的广泛使用已导致严重的环境问题。因此，急需一种环境友好的技术解决方法来去除土壤中残留的草甘膦。在本研究中，我们成功地分离出一种新型的菌株Chryseobacterium sp. Y16C，可有效降解草甘膦及其主要代谢物氨基甲基膦酸（AMPA）。我们发现菌株Y16C在4天内可以完全降解400 mg·L-1浓度的草甘膦。动力学分析表明，草甘膦生物降解具有浓度依赖性，最降解率、半饱和常数和抑制常数分别为0.91459d-1、15.79796mg·L-1和290.28133 mg·L-1。AMPA被确定为草甘膦降解的主要降解产物，这表明草甘膦首先通过切断其C-N键降解，随后再进行代谢降解。同时，我们还发现菌株Y16C能够耐受和降解的AMPA浓度高达800 mg·L-1。此外，菌株Y16C通过诱导土壤微生物群落的多样性和组成发生轻微变化，间接加速了土壤中草甘膦的降解。综上所述，我们的研究结果表明菌株Y16C可以作为草甘膦污染土壤生物修复的潜在微生物菌剂。
译名：一种新型草甘膦降解细菌Chryseobacterium sp. Y16C及其对草甘膦污染土壤中微生物群落影响的评价
从受有机农药污染的土壤中分离出Chryseobacterium sp. Y16C，进行形态学分析、理化性质测定和16S rDNA基因鉴定分析。进行细胞生长和草甘膦降解分析以及降解动力学分析，同时鉴定培养条件对菌株Y16C草甘膦降解能力的影响。鉴定草甘膦的生物降解产物，鉴定草甘膦在土壤中的生物降解及对微生物群落的影响，最后探究菌株Y16C对草甘膦胁迫下水稻种子萌发的影响。
从含有400 mg·L-1草甘膦的MSM培养基生长的活性污泥样品中分离出九种不同形态的菌株（补充图 S1）。菌株Y16C表现出最高的草甘膦降解能力，在培养的4天之内从MSM培养基中消除了100%的草甘膦。该菌株为革兰氏阴性菌，在过氧化氢酶、氧化酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、溶血和精氨酸二氢化酶试验中呈阳性反应，在厌氧生长、明胶液化、脲酶产生、吲哚产生和硫化氢产生方面呈阴性。菌株Y16C的生理生化特性在补充表S1中。微生物形态分析表明，菌株Y16C在LB琼脂平板上呈，不透明圆形，边缘光滑（补充图 S2A）。扫描电镜观察显示，菌株Y16C的细胞呈棒状，长度为1-3 μm，宽度为0.5-1 μm（补充图S2B）。16S rDNA基因序列分析表明，菌株Y16C属于金黄杆菌属，与Chryseobacterium sp. R6-353具有高度相似性（99.27%）。基于菌株Y16C和其他具有代表性的金黄杆菌属菌株16S rDNA基因序列的系统发育关系如图1所示。菌株Y16C的16S rDNA序列已提交至GenBank，登录号为MZ676068。根据菌株Y16C的形态、生理生化特征和16S rDNA基因分析，我们确定菌株Y16C为金黄杆菌属。该菌株保存于中国广东省微生物菌种保藏中心（保藏号码：GDMCCNo. 61817）。微生物降解是一种从环境中去除草甘膦的高效方法。先前已经分离和表征了几种草甘膦降解微生物。在之前的研究中已经分离和表征了几种降解草甘膦的微生物。然而，这些菌株在外界和原位环境中的适应性、生物降解效率等方面往往存在差异。目前已知的主要草甘膦降解菌株一般属于为不动杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和苍白杆菌属。本研究首次发现了金黄杆菌属菌株具有草甘膦降解的能力。前人的研究表明，金黄杆菌属能够降解其他有机污染物。例如， Chryseobacterium sp. PYR2具有多种有机氯农药（OCPs）的降解能力。具体而言，Chryseobacterium sp.PYR2可以在30天内降解80 - 98 %的六氯环己烷（HCH）或1，1，1 -三氯-2，2 -二（4 -氯苯基）乙烷（DDT）的异构体（50mg·L-1）。Zhao等人的研究首次发现，Chryseobacterium aquifrigidense利用氧氟草醚和其他二苯醚除草剂作为唯一碳源。此外，Chryseobacterium sp. JAS14是一种高效的多菌灵（MBC）降解菌，可在培养4到9天内完全降解水和土壤介质和中200 mg·L-1的MBC。菌株Y16C在以400 mg·L-1草甘膦为生长底物的MSM培养基中的细胞生长和草甘膦降解特性如图2所示。我们没有观察到滞后期，说明菌株Y16C不需要以草甘膦为底物的驯化期就能够开始生长。与对照相比，可以发现菌株Y16C细胞浓度逐渐增加，同时草甘膦残留率逐渐降低。在第4天，细胞浓度达到最大值，草甘膦被完全去除。与之相反，在未接种的对照中仅观察到轻微水平的草甘膦降解（13.08%）。这可能是由于草甘膦在液体环境中的光降解造成的。
不同菌株对草甘膦的降解能力不同。Kryuchkova等人从俄罗斯萨拉托夫地区草甘膦处理农田植物根际分离到的Enterobacter cloacae K7菌株。该菌株通过利用草甘膦作为唯一的磷源来生长，并且发现在草甘膦初始浓度为5 mM（845 mg·L-1）时的降解率达到40%。Góngora-Echeverría等人从生物混合液（土壤 -秸秆；1:1，v/v）中分离得到4株可以降解农药的菌株（Ochrobactrum sp.DGG-1-3，Ochrobactrum sp. Ge-14，Ochrobactrumsp. B18和Pseudomonas citronellolis ADA-23B），并将其用于农田农药的生物修复。培养15天后，这4株菌株对50 mg·L-1草甘膦的降解率均超过60%。在另一项研究中，在长期种植抗草甘膦大豆中分离得到了13株利用草甘膦为唯一磷源生长的细菌菌株。其中，Ochrobactrum haematophilum SR和Agrobacterium tumefaciens CHLDO表现出最好的草甘膦降解性能，培养3天后，草甘膦降解率分别达到56%和47%。在前人的研究中，大多数草甘膦降解细菌是使用草甘膦作为单一磷源来分离的。然而，很少有研究使用草甘膦作为单一碳源来筛选草甘膦降解细菌。Singh等人分离出了50种草甘膦降解细菌，除GP1（链霉菌属物种）、GP2（枯草芽孢杆菌）和 GP3（豌豆根瘤菌）外，其平均降解效率都在25%至60%之间。这三个菌株在培养14天后可以利用86-90%的250 mg·L-1草甘膦。Góngora-Echeverría等人的研究发现，菌株Ochrobactrum sp.SA，Ochrobactrum sp. SB，Pseudomona sp. SC和Pseudomona sp. SD可以把50 mg·L-1草甘膦作为唯一碳源，在15天时降解效率可达60 %。在本研究中，我们发现的菌株Y16C具有比上述菌株更高的草甘膦降解效率。
图2. 菌株Y16C在草甘膦降解过程中的生长。数据点表示一式三份的相同的重复（n = 3），误差线表示这些重复的标准差。
为了评估降解草甘膦微生物在实际应用中的潜力，分析初始pH值/浓度、接种量、培养温度等培养条件对微生物草甘膦降解特性的影响是十分必要的。菌株Y16C在不同培养条件下的草甘膦降解特性如图3A所示。因此，初始pH值对菌株Y16C降解草甘膦有显著影响。在初始pH7-9范围内，降解效率高于pH为酸性的范围，菌株Y16C在4天内可完全降解400 mg·L-1的草甘膦（p0.001）。在初始pH值为5和6时，草甘膦降解率分别达到 73.63% 和 81.08%。然而，对照组在所有pH水平下的降解率都很低。不同接种生物量浓度下草甘膦降解结果如图3B所示。由此可见，草甘膦降解率随接种量的增加而逐渐增加。菌株Y16C接种量在3 % ~ 5 %之间，3天内能完全降解400 mg·L-1草甘膦。不同温度下草甘膦降解情况如图3C所示。在30℃时，可以发现草甘膦降解效率高于其他温度水平下的降解效率。最后，图3D也表明，随着初始草甘膦浓度的增加，降解效率逐渐降低。但在初始草甘膦浓度为50 ~800 mg·L-1时，降解效率较高。如上所述，草甘膦生物降解受到初始 pH值、接种菌株生物量浓度、培养温度和草甘膦浓度以及许多其他因素的影响。pH值是影响微生物草甘膦降解的一个重要因素。我们的研究结果表明，菌株Y16C能够在较大的pH范围（5.0-9.0）内降解草甘膦，且在中性或碱性条件下的降解效率高于酸性条件下的降解效率。这可能是由于较低的pH值影响了草甘膦降解细菌的生长。然而，Fan等人的研究发现弱酸性条件会促进Bacillus cereus CB4的生长和草甘膦的降解。在pH值为6时，菌株Y16C对草甘膦的降解率最高可达94.13%。另一方面，Yu等人的研究发现Bacillus subtilis Bs-15降解草甘膦的最佳pH值为8。培养温度是另一个显著影响草甘膦降解能力的重要因素。在本研究中，我们发现菌株Y16C的草甘膦降解性能对温度敏感。超过一定限度的温度波动可能会通过影响生物活性来增加或降低草甘膦的去除率，从而减少草甘膦在细胞上的吸附。当温度过低时，这不利于细菌的生长。相反，当温度过高时，细菌生长过快，很快入衰退期。此外，适宜的接种量也有利于草甘膦的降解；接种量过少，会导致菌株生长缓慢，细胞活力低。当接种量过大时，菌株的生长周期缩短，导致生长代谢的底物不足。虽然菌株Y16C可以有效降解草甘膦，但草甘膦并不是其生长的最佳底物，具有一定的毒性。随着草甘膦浓度的增加，其降解活性也会降低。
图3. 培养条件对菌株Y16C降解草甘膦能力的影响。A：初始pH；B：接种量；C：培养温度；D：草甘膦浓度；数据点表示三个相同重复的均值（N = 3），误差线表示均值的标准差， ***p 0.001。
草甘膦初始浓度与菌株Y16C细胞特异性草甘膦降解速率之间的动力学关系如图4A和表S2所示。由于菌株Y16C对草甘膦的降解具有浓度依赖性，因此采用底物抑制模型拟合了不同初始浓度草甘膦的降解速率（q）。通过非线性回归分析确定该模型的动力学参数Ki、Ks和qmax分别为290.28133 mg·L-1、15.79796 mg·L-1和0.91459 d-1。通过计算Ki、Ks的平方根，确定临界浓度（Sm）为67.71893 mg·L-1。R2为0.98935，表明实验数据与模型预测吻合较好。AMPA 是草甘膦生物降解产生的主要代谢物。在本研究中，菌株Y16C被证实可以耐受和降解浓度高达800 mg·L-1的AMPA。如图4B所示，随着初始浓度的增加，AMPA的降解速率逐渐降低，说明菌株Y16C对AMPA的降解也符合底物抑制动力学模型。模型的参数Ki、Ks、Sm和qmax对AMPA的抑制作用分别为106.50601 mg·L-1、24.00406 mg·L-1、50.56260 mg·L-1和 0.33271 d-1。这表明菌株Y16C的草甘膦降解活性大于AMPA降解活性。AMPA被土壤颗粒吸。
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