白酒是我国酿造历史悠久的传统酒类，开放的生产方式使其在发酵过程中涉及多种微生物共同参与。研究显示，白酒中含有上千种风味物质，这与其由多种微生物参与发酵密不可分。鉴别微生物种类、准确了解白酒发酵过程中微生物群落结构及其随时间变化的规律是研究白酒发酵微生物的主要内容。高分辨的菌种注释为揭示白酒微生物群落结构、演变及自组装提供了基础。与二代短片段测序相比，以PacBio SMRT为代表的三代测序技术具有长读长、高通量的优点，通过其特有的CCS（circular consensus sequencing）模式，可将同一条序列多次重复测序后的结果相互校正，从而获得测序质量非常高的一致性序列。借助该技术，研究人员可以进一步获得种水平的物种组成，得到更好的物种注释分辨率，进一步深入解析群体样本的物种组成情况。
内蒙古农业大学食品科学与工程学院的乔美灵、任宇婷、满都拉*等以中国传统清香型白酒为研究对象，利用PacBio SMRT测序技术结合统计学方法深入解析清香型白酒发酵过程中细菌物种组成及群落结构，进一步利用iCAMP模型开展清香型白酒发酵过程中群落自组装机理的研究。
经测序共获得413 198 条细菌CCS序列（均长度为1 500 bp），以97%相似性划分共得到1 761 个OTU。Shannon指数和Simpson指数表征样品中群落的多样性信息，Shannon指数越大、Simpson指数越小，表示群落多样性越高。如图1A、B所示，细菌群落的Shannon指数0 d最高随后逐渐降低，Simpson指数0 d最低随后逐渐升高，说明随发酵进行细菌群落多样性逐渐降低，发酵起始（0 d）时上述两个指数均与发酵结束（28 d）时存在显著差异（
P＜0.05）。总体来看，发酵12 d后是发酵过程中细菌多样性变化的关键时间段。Chao1指数表征样品中群落的丰度信息，其值越大代表物种总数越多。本研究中，随发酵的进行，细菌菌群的Chao1指数总体呈下降趋势，这表明随着发酵进行物种数逐渐降低，除0 d与10 d的Chao1指数差异显著（P＜0.05）外，其余无显著差异（图1C）。如图1D所示，覆盖率均大于0.99，说明样本文库的覆盖率较高。Shannon-Wiener曲线随着测序量的扩大，最终均达到饱和状态（图1E），测序深度满足要求。从多样性（Simpson、Shannon指数和Chao1指数）变化可以看出，由于入缸时带入不同来源的微生物，细菌群落的微生物多样性在0 d达到最大，之后由于发酵过程的进行，微生物需要适应环境的变化以及菌群之间的相互作用导致细菌多样性发生动态变化。
如图3A所示，发酵0 d样品与其他时间样品存在显著差异，成为单独一个分支。其他时间样品又分为3～10 d和12～28 d两个分支，说明整个发酵可分为3 个阶段：0（I）、3～10 d（II）和12～28 d（III）。PCoA结果（图3B）显示，PCo1的贡献率为55.3%，权重最大，说明细菌群落随发酵过程的推进主要沿PCo1轴方向发生变化，并且沿PCo1轴正方向相邻时间点样本的间距越来越小，说明群落结构逐渐趋于一致，这与聚类分析结果一致。综上，发酵第0、3、12天可能是反映整个发酵过程微生物群落动态变化的主要时间节点。进一步利用方差分析（图3C）研究3 个发酵阶段的差异性发现，3 组组间差异大于组内差异，且差异显著（
为进一步明确不同发酵阶段中具有显著差异物种信息，通过LEfSe分析研究各阶段差异菌种。如图3D所示，各发酵阶段细菌群落的差异物种主要来自8 个属，大部分为优势属，但阶段II中没有差异菌属。其中阶段I有11 个显著性差异物种，分别为
r＞0.60、P＜0.05作为网络强相关节点的条件筛选出10 个菌种，进行绘图，如图4所示。细菌群落中L.acetotolerans与各发酵阶段的差异细菌具有显著相关性（P＜0.05）。阶段I的差异菌种之间均呈正相关，其中A.malorumW.cibariaA.pasteurianusK.intermediusP.pentosaceusG.oxydansL.sakei，这些菌种具有较高的有机酸和乙酸生产能力，可以导致酒醅酸化，维持发酵的正常进行，也为乳酸乙酯的合成提供了前体物质；L.siliginis多分离于酸面团中；而L.mesenteroidesB.licheniformis可以释放各种酶水解酒醅中的蛋白质和淀粉，为发酵过程中微生物提供物质及能量。阶段II的差异菌种之间呈正相关，其中L.paralimentarius利用葡萄糖发酵产酸，L.plantarum可产丁酸，L.brevis具有较高的-氨基丁酸生产能力，而L.cerevisiae在白酒中的研究较少，其在白酒酿造过程中的具体作用还需进一步研究。阶段III的3 个差异菌种之间也呈正相关，L.pontis为异型发酵乳酸菌，可改善面包的风味和味道，L.acetotolerans可以促进具有水果味、花香和甜香酯类物质风味的产生，L.hilgardii参与葡聚糖的产生，促使某些细菌的生长。发酵过程中微生物群落结构的差异影响微生物之间的相互作用。不同发酵阶段的差异菌种之间呈负相关，同一发酵阶段的差异菌种之间呈正相关，这是可能由于各阶段的“分工”不同导致微生物之间存在竞争和共生等关系。
如图5所示，随着发酵的进行，理化因子呈明显动态变化。水分含量、酸度和蛋白含量呈现上升趋势，淀粉含量和pH值呈现下降趋势。而温度呈现先上升后下降趋势，氨基酸态氮和乙醇含量呈现先升高后降低再升高的变化规律。
基于CCA将微生物群落与理化因子进行关联分析，排序轴CC1贡献率为54.19%，排序轴CC2贡献率为28.44%（图6A）。pH值和淀粉含量主要影响阶段I的细菌群落，其中淀粉含量的影响最大，在这一阶段中淀粉分解成还原糖，充足的糖供应有利于微生物的生长和代谢。温度和氨基酸态氮含量主要影响发酵阶段II的细菌群落，其中温度对细菌群落的影响最大，温度的变化反应酒醅发酵是否正常，这是微生物的生长代谢产生生物热与酒醅发酵环境热能传递平衡的结果。酸度、水分和蛋白质含量主要影响发酵阶段III的细菌群落，其中水分含量影响较大，水分含量是酿酒过程中关键指标之一，酒醅所含水分含量影响发酵空间的气密性，水分含量偏高导致发酵的气密性差，抑制好氧菌的生长，增加厌氧菌的生长，容易发生酸败；如果酒醅水分含量偏低，对出酒率和酒品质都有影响。差异菌种与环境因子相关性（图6B）表明，阶段I的差异菌种主要与pH值呈正相关，与酸度呈负相关，其中
P.pentosaceus呈高度正相关（P＜0.001）。阶段II的差异菌种主要与温度呈正相关，其中L.plantarumL.cerevisiae与温度高度相关（P＜0.001）。在阶段III的差异菌种中L.acetotolerans与水分和酸度呈高度正相关（P＜0.001），与pH 值、温度呈高度负相关（P＜0.001），这表明不同种类的细菌受不同环境影响较大，具体情况还需对菌株进一步分离验证。
微生物群落变化通常归于两种现象：物种替换（不同样本间物种交换和替代）和物种流失（物种的增加或减少）。如图7A、B所示，本研究的发酵过程中物种替换（图7B）几乎贡献了大部分的细菌群落演替。随着发酵过程的进行，物种替换呈现先上升后下降再上升的变化趋势，与物种流失（图7A）呈现相反的变化。阶段I细菌群落的替换最低，可能是由于环境细菌的进入导致细菌多样性增加，而阶段II、III，由于在发酵过程中微生物的代谢活动导致酿造环境发生变化，从而使替换迅速升高。总之，替换是群落演替的主要机制，同时流失对于细菌群落结构的演替也至关重要。不同发酵阶段的替换发生率呈现上升趋势，表明发酵阶段中的细菌群落中的物种在不断发生交换和替代，细菌群落因发酵过程的进行而发生演替。
为探索确定性和随机性对微生物群落组装的相对重要性，基于零模型的NST进行评价，如图7C所示，随机过程主导了整个发酵过程中细菌群落的组装结果。发酵过程中细菌群落的绝大部分NST＞0.5，表明整个过程主要受到随机性过程的影响。而在阶段II和III，少数细菌群落也会受到确定性（NST＜0.5）的影响，表明随着发酵过程的进。
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